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TECNICA MICROCROMATOGRAFICA EN CARBOXIMETILCELULOSA CM-52 PARA CUANTIFICAR LA HEMOGLOBINA A2 EN INDIVIDUOS CON HEMOGLOBINA AC.
Por:
Lic. Jorge L. Cabrera Llano*, Dra. Maricel F. Castellanos González** y Dr.Sc. Pedro C. Hidalgo Calcines***
* Licenciado en Química. Asistente. Laboratorio de Genética Humana.
ISCM-VC.
** Doctora en Medicina. Especialista de I Grado en Bioquímica
Clínica. Laboratorio de Genética Humana. ISCM-VC.
*** Doctor en Ciencias. Profesor Titular. Laboratorio de Genética
Humana. ISCM-VC.
RESUMEN
La hemoglobina A2 no se separa de la hemoglobina C por la mayoría de las técnicas electroforéticas o cromatográficas. Esto dificulta el diagnóstico de la C/Beta talasanemia mediante la cuantificación de la concentración de la hemoglobina A2 (HbA2). Esta investigación muestra los resultados del estudio realizado a 15 embarazadas portadoras de hemoglobina AC, a las que se les cuantificó la HbA2 mediante una nueva técnica microcromatográfica en carboximetilcelulosa CM-52. La técnica es sencilla, relativamente rápida y económica. Los valores normales se encuentran en el rango de 2,4 a 3,8 %. Estos son ligeramente superiores a los encontrados con esta técnica para individuos con hemoglobina AA (1,5-3,7 %).
Palabras claves:
- CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO
- HEMOGLOBINA A2
- HEMOGLOBINA C
- HEMOGLOBINA A
INTRODUCCION
La macrocromatografía en carboximetilcelulosa CM-52 y amortiguador Imidazol-HCl-KCN-NaCl posibilita la separación de la HbA2 y diferentes variantes de Hb humana en 36 horas (resultados no publicados). Esto nos motivó a buscar un nuevo procedimiento microcromatográfico más sencillo, económico y rápido, que permitió cuantificar la HbA2 en individuos portadores de HbAC.
MATERIAL Y METODO
Las muestras de sangre se obtuvieron de las embarazadas que asisten al Laboratorio de Genética Humana del Instituto Superior de Ciencias Médicas de Villa Clara, para el pesquisaje de prevención de la anemia por hematíes falciformes.
La sangre se obtuvo por punción venosa, se mezcló con heparina en una relación de 10 unidades por ml de sangre y se conservó a 4oC hasta el momento de su estudio.
Los hemolizados se obtuvieron de acuerdo con Huisman1, y se conservaron a -20oC hasta el momento en que se utilizaron.
La cuantificación de HbA2 se realizó mediante macrocromatografía2 y por microcromatografía.
Microcromatografía:
Se prepararon 3 soluciones a partir del amortiguador matriz Imidazol - HCl 0,02 mol/1 - KCN 0,01 % (P/V), y se ajustó a pH de 6,85.
La solución denominada A contenía amortiguador matriz + NaCl 0,02 mol/l. La solución B contenía amortiguador matriz + NaCl 0,03 mol/l, y la solución C estaba constituida por amortiguador matriz + NaCl 0,10 mol/l.
Se pesaron 100 g de carboximetilcelulosa Cm-52 (Whatman, Inglaterra) y se mezclaron con suficiente amortiguador matriz hasta un volumen de 400 ml; se agitó suavemente durante 5 min, se dejó reposar y se decantó el sobrenadante. El proceso se repitió 3 ó 4 veces hasta que la resina estuvo equilibrada a pH de 6,85. La resina se conservó a 4oC hasta que se empleó.
Como columnas se utilizaron pipetas de vidrio de 0,5 cm de diámetro, convenientemente recortadas. En ellas se colocó una esponja sintética en el extremo y se añadió la resina hasta una altura de 3 a 3,5 cm.
La muestra se preparó por dilución de una gota del hemolizado en 6 gotas del amortiguador matriz (3-5 mg); ésta se aplicó sobre la parte superior de la resina y se dejó penetrar en la misma.
Luego se le añadió la solución A y se comenzó a colectar la HbA, la cual eluye entre los 5 y 6 ml, y se colectó hasta los 15 ml; el eluato se completó a 25 ml con agua destilada.
Posteriormente, se extrajo de la columna el excedente de la solución A y se comenzó a añadir la solución B, con la cual eluye la HbA2 entre los 3 y 4 ml. Se completó el eluato a 10 ml con agua destilada.
Finalmente se extrajo de la columna la solución B y se añadió a continuación la solución C. La elución de la HbC se llevó a cabo hasta observar la resina sin vestigios de Hb; luego se completó el eluato a 25 ml con agua destilada.
La DO de cada fracción se determinó en cubeta de 2 cm de recorrido óptico a 415 nm. El por ciento de HbA2 se calculó mediante la siguiente fórmula:
DOA2
% de HbA2 = ___________________________________ x 100
2,5 (DO A) + 2,5 (DOC) + DOA2
En forma análoga puede calcularse el por ciento de HbC.
Los datos se procesaron mediante la prueba "t" de Student para series pareadas; se utilizaron valores analíticos de un solo grupo de muestras, pero obtenidas por parejas, con dos métodos diferentes3.
Teniendo en cuenta el número pequeño de observaciones, se determinó el rango normal de los valores de HbA2 dentro de la muestra estudiada utilizando la tabla de valores K, con un límite de confianza de p = 0,053.
RESULTADOS Y DISCUSION
En la tabla se muestran las estadísticas obtenidas por la macrocromatografía y la nueva técnica microcromatográfica, con el empleo de amortiguador fosfato e Imidazol-HCl-KCN-NaCl, respectivamente.
Tabla: Estadísticas para la macrocromatografía y la microcromatografía de la HbA2.
| Macro | Micro | ||
| Fenotipo | AC | AC | AA |
| Hb | n = 13 | n = 15 | n = 20 |
| X ± DE | 3,2 ± 0,22 | 3,1 ± 0,25 | 2,6 ± 0,40 |
| X ± KDE | 3,2 ± 0,66 |
3,1 ± 0,72 K = 2,954 |
2,6 ± 1,10 K = 2,752 |
| Intervalo % | 2,6 - 3,7 | 2,7 - 3,7 | 2,1 - 3,4 |
La concentración de HbA2, obtenida por ambas técnicas, no mostró diferencias significativas (t=1,98; g.1=12; p > 0,05) en los individuos portadores de HbAC.
La concentración de HbA2, en individuos con HbAC, fue más alta que la encontrada en adultos homocigotos para la HbA. Resultados similares fueron hallados por Abraham y col en 6 individuos heterocigotos para la HbAC utilizando el amortiguador fosfato2.
Se ha observado un aumento de la concentración de la HbA2 en portadores de HbAS (x = 2,8; 1,6 - 3,9 %)4; éste representa un valor intermedio entre los homocigotos para la HbA y heterocigotos AC. Tales diferencias entre los grupos AA, AS y AC puede deberse a diferencias en la afinidad y a la competencia entre las cadenas Beta A, Beta C y delta por las cadenas alfa5,6.
La cuantificación de HbA2 por la microcromatografía descrita, a 10 alícuotas de un mismo hemolizado con HbAC en el mismo día y una diaria durante 10 días, demostraron un coeficiente de variación menor que el 10 %, lo que permite considerar la técnica con suficiente precisión para los fines analíticos planteados.
La pureza de cada una de las fracciones eluidas se comprobó al reunir los eluatos hemoglobínicos idénticos de una misma muestra repetidas veces, concentrarlos e identificarlos fenotípicamente por electroforesis en gel de almidón pH 8,61.
La técnica microcromatográfica es sencilla y relativamente rápida (aproximadamente 2 horas). Desde el punto de vista económico, posibilita un ahorro de reactivos y de tiempo al compararla con la macrocromatografía. En una jornada de 8 horas se pueden analizar 40 muestras o más.
El empleo de la macrocromatografía permitió el diagnóstico de una embarazada con C/Beta+ talasanemia y otra con una variante de HbA2. Con nuestra microcromatografía pudimos diagnosticar la C/Beta+ talasanemia (HbA2 = 4,5 %; HbC = 50 %) pero no se separó la variante de HbA2. En ensayo con muestras AS demostró que no es posible la cuantificación de HbA2 en estos individuos mediante esta técnica microcromatográfica.
Los hemolizados conservados a -20oC dieron resultados reproducibles hasta los 10 días después de su preparación. Al cabo de este tiempo se observó una disminución ligera de la concentración de HbA2, lo cual puede deberse al proceso de desnaturalización de la Hb por el envejecimiento.
La técnica microcromatográfica permite cuantificar la HbA2 y la HbC en individuos con HbAC, pero no posibilita la cuantificación de HbA2 en individuos con HbAS, ni de variantes de HbA2.
SUMMARY
Hemoglobin A2 does not split from hemoglobin C using most of the electrophoretic or chromatographic techniques. This makes difficult the diagnosis of C/ß thalassemia using the quantification of hemoglobin A2 (HbA2) concentration. The results of a study of 15 hemoglobin AC-carrier pregnant women are shown in the present work. HbA2 was determined using a new microchromatographic technique in carboxymethylcellulose CM-52. This is a simple, relatively quick and non-expensive technique. The normal values are within the range of 2,4 to 3,8 %. These are slightly higher than those found with this technique in Hemoglobin AA individuals (1,5-3,7 %).
Key words:
- CHROMATOGRAPHY, ION EXCHANGE
- HEMOGLOBIN A2
- HEMOGLOBIN C
- HEMOGLOBIN A
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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Huisman THJ, Jonxis JH. The Hemoglobinopathies. Techniques of Identification. New York : Marcel Dekker, 1977:70-71,96.
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Abraham EC, Huisman THJ, Schroeder WA. Detection of some uncommon hemoglobin variants and two rapid methods for the quantitation of HbA2 in the presence of HbC. J of Chromatogr 1973;143:57-63.
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Thielman K. Principios de Metodología en Bioquímica Clínica. La Habana : Edit Organismos. Inst. Cubano del Libro, 1973:54-59.
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Whitten WJ. The proportion of HbA2 is higher in sickle cell trait than in normal homozigotes. Hemoglobin 1981;5:371.
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Bunn HF. Subunit Assembly of hemoglobin : An important determinant of hematologic phenotype. Blood 1987;69(1):1- 6.
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Martínez G, Menéndez R. Differences in affinity of Beta and delta hemoglobin chains for alpha chains. A possible explanation for the variation in the porcentages of Hemoglobin A2 in thalassemia and other disorder. Biochem Biophys Acta 1983;743:256.
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